Zkušenosti se stanovením avidity protilátek třídy IgG proti zarděnkám v ELISA  (Referát)

Předneseno na XIII. pracovní konferenci mikrobiologických laborantů,
Hradec Králové, 22.-24.října 2002.

J.Raszka, M. Švajdová, H.Rulíšková

Úvod

1) Zarděnky

jsou benigní virové exantematické onemocnění. Infekce je však nebezpečná, pokud dojde k nákaze těhotné ženy v prvním trimestru těhotenství, vzhledem k možnosti přenosu nákazy na plod, s rizikem jeho těžkého postižení. Sérologicky potvrzená diagnóza rubeoly je indikací k interrupci.

2) Hodnocení sérologického výsledku.

Dosud bylo hodnocení sérologických výsledků založeno na posouzení dynamiky tvorby a přítomnosti protilátek třídy IgG a IgM. Průkaz IgM  protilátek nemusí být vždy rozhodující, protože jejich tvorba je ovlivněna řadou faktorů. Přítomnost IgM protilátek, která nesouvisí s nákazou zarděnkami, může být detekována jako reakce organismu na jinou probíhající infekci, kupříkladu nákazu EBV. Je pak velmi obtížné rozhodnout, zda je nález IgM protilátek výrazem primoinfekce. Na druhé straně můžeme obdržet negativní výsledek testu, jednak z důvodu nedostatečné tvorby IgM protilátek nebo pozdního odběru prvního vzorku krve, kdy může dojít k poklesu hladiny IgM protilátek na nedetekovatelnou hodnotu.

3) Avidita protilátek třídy IgG

Avidita protilátek je obecný imunologický pojem, který vyjadřuje pevnost vazby mezi antigenem a protilátkou a je užíván k popsání úrovně rezistence komplexu antigen-protilátka k působení denaturujících agens. Na začátku imunitní odpovědi tvoří organismus velké množství protilátek proti různým epitopům antigenu a jejich afinita (přilnavost) k těmto vazebným místům je různá. Souhrnně označujeme pevnost této vazby termínem avidita. V první fázi infekce je její hodnota nízká. Vyzrávání imunitní odpovědi má za následek tvorbu plazmatických buněk, které tvoří protilátky cíleněji a zároveň dochází ke kompetici o antigen. Protilátky s vyšší afinitou vychytávají antigen snáze a rychleji. To se v konečném důsledku projeví vzestupem avidity protilátek v pozdější fázi infekce.

V akutním období infekce je avidita protilátek nízká a postupně narůstá. V latentní fázi onemocnění jsou protilátky vysoce avidní a pokud dojde k reinfekci, tvoří paměťové  buňky přímo protilátky s vyšší aviditou .

Principem stanovení avidity je zjištění, do jaké míry naruší denaturační činidlo (v našem případě urea) pevnost vazby mezi antigenem a protilátkou. Protilátky s nízkou afinitou jsou z vazby na antigen působením činidla uvolněny a odstraněny promývacím cyklem. Protilátky s vyšší afinitou odolávají působení denaturačního činidla a z vazby se tak snadno neuvolní.

Metodika

Stanovení avidity IgG protilátek.

 Bylo provedeno enzymovou imunoanalýzou dg setem firmy Sorin. Dle návodu výrobce se séra pacientů testují paralelně ve dvou jamkách soupravy. Po první inkubaci a navázání na antigen se na jednu jamku nechá působit po přesně stanovený čas (5 minut) denaturační činidlo (8 mol/l urea), zatímco druhá jamka je ponechána prázdná. Na konci testu porovnáváme naměřenou absorbanci u jamky s ureou a bez urey. Přítomnost nízkoavidních protilátek se projeví výrazným snížením absorbance po opracování ureou (v promývacím cyklu došlo k jejich odmytí). Výsledek vyjadřujeme jako podíl absorbancí jamky s ureou a neopracované jamky.Vypočtený podíl násobený stem vyjadřuje hodnotu avidity v procentech. Hodnota cutt – off  pro aviditu IgG protilátek je výrobcem udávána 55%, do šedé zóny zahrnujeme hodnoty mezi 45 – 65 %. Nález hodnot nižších než 45 % svědčí pro čerstvou nákazu (méně než 4 měsíce), hodnoty vyšší než 65 % informují o pozdní infekci (starší 4 měsíců) nebo o reinfekci.

Výsledky

V našem příspěvku jsou zpracovány výsledky vyšetření z období epidemie zarděnek, která proběhla v letošním roce v Moravskoslezském kraji.

V období od září minulého roku do srpna 2002 bylo na našem oddělení vyšetřeno celkem 2564 osob. Časové rozvrstvení je patrno z grafu.

Byly sestaveny  dva soubory vzorků: pacientů s přítomnosti IgM protilátek a pacientů bez protilátek třídy IgM. V těchto souborech jsme  srovnali závislost % avidity IgG na hodnotách absorbance IgG jednotlivých pacientů. Oblast šedé zóny avidity IgG je vyznačena na grafech tmavším pozadím.   

První soubor ilustruje závislost avidity protilátek IgG na absorbanci v testu IgG u 225 sér pacientů s nálezem IgG a IgM protilátek. Je možno říci, že se vzrůstající hodnotou absorbance IgG dochází k vzestupu indexu avidity. Protože se však jedná o soubor osob s nálezem IgM protilátek, nachází se převážná většina hodnot indexu avidity v oblasti do 45%.

V dalším souboru jsme srovnávali výsledky u 159 vzorků s nálezem IgG protilátek bez přítomnosti IgM. Tady vidíme, že většina hodnot se nachází ve vyšší hladině a se vzrůstající absorbancí stoupá i hodnota indexu avidity.

Tabulka č. 4 ukazuje dynamiku tvorby avidních protilátek u pěti pacientů, u kterých byl proveden opakovaný odběr.

Závěr

Naše zkušenosti se stanovením avidity specifických protilátek třídy IgG potvrdily předpoklad, že metoda je vhodná rovněž pro laboratorní diagnostiku zarděnek.

Stanovení avidity protilátek IgG vhodně doplňuje serologickou diagnostiku zarděnek, umožňuje přesnější stanovení recentní nákazy, hodnocení výsledku má pak jednoznačně vyšší validitu.